ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ БИОЛОГИЯ
И НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

Общее собрание Сибирского отделения РАН, прошедшее в середине декабря прошлого года, было названо председателем СО РАН академиком Н.Добрецовым экспериментальным, ибо проводилось в виде научной сессии. А начиналась сессия с доклада директора Института цитологии и генетики, академика РАН В.Шумного, посвященного 50-летию открытия двойной спирали ДНК, величайшего события в биологии. Тема была развита затем в ряде сообщений и выступлений.

В.Шумный, академик

50 лет назад была создана модель двойной спирали ДНК. Все крупные события в науке, в том числе и открытие двойной спирали ДНК, связаны с определенными именами ученых. В историю прочно вошло понятие, что двойная спираль ДНК, это спираль Уотсона и Крика. Но, чтя эти имена, мы все-таки не должны забывать, что за ними стояли выдающиеся ученые, которые подготовили это открытие. Поэтому я позволю себе несколько минут посвятить их работам.

Первый вопрос, на который следовало ответить — а есть ли ген, существует ли вообще какая-то генетическая структура? Он мучил Аристотеля, Ламарка, Дарвина и многих других. Точку поставил выдающийся естествоиспытатель Грегор Мендель. Скромный учитель в монастырской школе, преподающий математику, физику и биологию, занялся опытами над растительными гибридами. Он скрестил разные формы гороха, контрастные по определенным признакам, четко проследил расщепления в поколениях и пришел к совершенно определенному выводу: да, есть наследственный фактор, он четко наследуется и передается в поколениях, никуда не исчезает. Грегор Мендель открыл явление доминирования и ввел в генетику понятие дискретности. То есть, фактически понятие гена, хотя само название появилось через 35 лет.

Сам Мендель опубликовал всего одну работу "Опыты над растительными гибридами". Она оставалась непонятой 35 лет, и единственный человек, который ее прочитал и написал Менделю письмо — известный ботаник Нагели. Поблагодарив его за работу, ученый посоветовал (лучше бы он этого не делал) повторить опыты на другом объекте и подсказал, что таким объектом может быть растение ястребинка. Мендель повторил опыты, и у него не воспроизвелись те расщепления, которые он получил на горохе, так как это растение размножалось вегетативно через апомиксис, у него и не должно наблюдаться расщепление, как при половом размножении. Разочарованный исследователь ушел в духовную сферу деятельности, стал крупным католическим деятелем, аббатом, настоятелем монастыря в Брно. Его работа была понята и оценена только в 1900 году.

Но после того, как в 1900 году Иогансен назвал менделевский фактор геном, встал второй вопрос: а что такое ген? Что за структура? На вопрос ответил наш соотечественник Николай Константинович Кольцов. Выдающаяся личность, он создал одну из самых мощных в мире генетических школ. И первым дал ответы фактически на все вопросы современной молекулярной биологии и генетики. Ученый постулировал, что хромосома состоит из макромолекул, причем, эти макромолекулы воспроизводятся. То есть, он ввел понятие матричного синтеза макромолекулы. Единственная ошибка, которую сделал ученый — все эти свойства он приписывал белкам, так как нуклеиновые кислоты были еще мало изучены. Фактически полностью расшифровал структуру нуклеиновой кислоты опять же наш человек, Левин, который закончил Санкт-Петербургскую медико-хирургическую академию в чине капитана русской армии. Он уехал с родителями в Америку еще до революции. В своих исследованиях он расшифровал структуру нуклеиновых кислот, вскрыл структуру сахарных остатков, рибозы и дезоксирибозы, определил все нуклеотиды, дал им названия. Но Левин тоже сделал одну ошибку. Он считал, что нуклеотиды соединяются в тетрануклеотид, который потом тупо повторяется в этих макромолекулах. И таким образом закрыл интерес к нуклеиновым кислотам, как информационным молекулам, на многие годы. Из-за этого, к сожалению, и не получил Нобелевскую премию за расшифровку нуклеиновых кислот, хотя вполне ее заслуживал.

Дальше события разворачивались следующим образом. Тимофеев-Ресовский, ближайший ученик Кольцова, уехав в Германию, вывез идею макромолекулы. Там он организовал подобие кольцовских семинаров (в институте Кольцова они назывались сооры — совместное орание, где производился мозговой штурм идей в одно касание). Тимофеев-Ресовский привлек к биологическим проблемам крупнейших физиков. Среди них был молодой Макс Дельбрюк, который воспринял идею макромолекулы. Дельбрюк, уехав в Америку, организовал там фаговую группу и был активным пропагандистом кольцовской идеи макромолекулы.

В группе Дельбрюка стажировался Джеймс Уотсон. В 21 год он уже имел докторскую степень, в 22 года появился в Кембридже для освоения метода рентгеноструктурного анализа белков и нуклеиновых кислот. Первое, что ему пришлось сделать, — сесть в одну рабочую комнату с Френсисом Криком. В первом же разговоре выяснилось, что оба придерживаются мнения, что кольцовская макромолекула — не белок, а нуклеиновая кислота. И это решило их дальнейшую судьбу.

Рядом работали Розалина Франклин и Уилкинс, рентгеноструктурщики, которые изучали рентгенограммы белков и нуклеиновых кислот. Эти рентгенограммы попали в руки Уотсона, и он сразу понял, что нуклеиновая кислота — это двойная спираль. И буквально через два месяца они ее построили. В мае 1953 года в "Nature" вышла их работа о двойной спирали молекулы ДНК. Затем они сделали стереомодель, и все стало на свои места.

Я бы хотел подчеркнуть: идея прежде прошла через Кольцова, Тимофеева-Ресовского, Дельбрюка — к Уотсону. Именно из кольцовской идеи родилась двойная спираль ДНК. Но к 1952 году еще не было полностью доказано, что нуклеиновые кислоты являются носителями наследственной информации.

И тут нужно вспомнить работы Гриффитса и Эвери по трансформации у бактерий, Сергея Михайловича Гершензона — по мутагенному эффекту тимонуклеиновых кислот, Иосифа Абрамовича Раппопорта — по химическому мутагенезу и целый ряд других, подтверждающих, что именно нуклеиновая кислота — наследственный материал.

Итак, была поставлена самая важная точка в молекулярной биологии и генетике — ген является структурой нуклеиновой кислоты.

Дальше все пошло уже быстрее. Работы Уотсона, Крика, Уилкинса и Розалины Франклин добавляли доказательства этому. Р.Франклин фактически дала те снимки, рентгенограммы, по которым и стало понятно, что это двойная спираль. К сожалению, Франклин не дожила до Нобелевской премии, ее получили Уотсон, Крик и Уилкинс в 1962 году.

Затем стало ясно, как идет репликация ДНК. Расплетаются родительские цепи, и каждая цепь строит себе комплементарную цепь, где аденин соединяется с тимином, а гуанин — с цитозином. Комплементарность четко прослеживается, и именно по этой комплементарности строятся новые цепи ДНК.

Итак, все стало ясным, кроме одного: а как кодируется наследственная информация в молекуле ДНК? Здесь опять я должен отметить нашего выдающегося физика Георгия Адамовича Гамова, однокурсника Ландау. Он первый определил фактически все понятия генетического кода и в первую очередь его триплетность. К 1964 году генетический код был расшифрован полностью.

Предполагалось, что расшифровка генетического кода займет примерно 50 лет. Работа была выполнена за десять лет.

Хочу подчеркнуть, что примерно из 20 ученых, которые осуществили эту революцию, 7 были российские и советские: Кольцов, Вавилов, Тимофеев-Ресовский, Раппопорт, Гершензон, Гамов и Левин. Все они могли с полным правом претендовать на Нобелевскую премию, ибо сыграли выдающуюся роль в открытиях 20 века, осуществив тот прорыв, который называют в биологии новой ген-инженерной или биотехнологической революцией.

Это то, что касается истории. Теперь — о некоторых генетических системах, которые в настоящее время вызывают очень серьезный интерес. Начну с системы, за генетическую расшифровку механизма которой в 2002-м году два американца и англичанин получили Нобелевскую премию. Она называется апоптоз. Работу выполнили на нематоде, черве, который имеет, как они просчитали, всего 959 клеток. В результате деления получается 1090 клеток. 131 клетка убирается в результате апоптоза. Это самоубийство клетки или программируемая клеточная смерть, которая осуществляется в тех случаях, когда клетка лишняя или когда она поражена, инфицирована, т.е. дальше не должна участвовать в развитии организма. Как это происходит? Поступает сигнал, который активирует комплексы генов нуклеазы, каспазные гены. Нуклеазы режут ДНК, сначала на длинные фрагменты, потом более короткие. Включается второй каскад, где ферменты каспазы режут белки. Затем на поверхности клетки появляется сигнал "eat me", или "ешь меня", макрофаги берут эту клетку, обволакивают и постепенно разбирают на запчасти, удаляя абсолютно безболезненно. Потому что есть еще один механизм гибели клеток, некроз, когда клетка лопается. Это сопровождается серьезными воспалительными процессами.

Расскажу о работах института по данному направлению. Работа доктора Н.Дыгало по формированию головного мозга у млекопитающих. При этом половина клеток удаляется через апоптоз. То есть, в процессе формирования головного мозга отсекаются миллиарды клеток, и только тогда формируется нормальный и структурно, и функционально мозг. Если мы заблокируем (а такие методы сейчас есть) формирование каспаз (это "ножницы", которые режут белки), то идет неконтролируемое формирование мозга, он получается крупный по размерам, деформированный, и такие особи, в основном, не выживают. Если, наоборот, дать разгуляться каспазам, то это тоже приведет к деформированному развитию мозга, и такие особи, как правило, погибают. Н.Дыгало показал динамику активности каспаз в процессе нормального формирования мозга.

Другая работа связана с онкологией. На одной из линий мышей СВА с лимфосаркомой у 100% особей показано, что при химотерапии мы получаем эффект только в том случае, если индуцируем тотальный апоптоз.

На лимфосаркоме проверено несколько вариантов химотерапии в смесевых препаратах, а потом подобран один, циклофосфан, и подобрана доза, которая вызывает стопроцентный апоптоз, то есть, стопроцентную гибель раковых клеток. Только в том случае, если подобрана концентрация, которая вызывает стопроцентный апоптоз раковых клеток, нет рецидивирования опухоли. Значит, на сегодня можно сделать довольно серьезные коррективы в химотерапии.

Думаю, в дальнейшем, вместе с Медакадемией мы рассмотрим некоторые вопросы организации диагностических методов химотерапии.

Наши теоретики составили генную сеть по апоптозу. Это сложнейшая сеть, включающая сотни генов. Но в ней есть главное звено — белок Р-53. Это триггерная система. Если клетка поражена, если нуклеиновая кислота имеет какие-то повреждения, белок Р-53 останавливает клеточный цикл и ждет, пока пройдет репарация клетки, особенно нуклеиновой кислоты. Если репарация прошла правильно, триггер перебрасывается на разрешение к дальнейшему делению. Если репарация прошла с ошибками, триггер перебрасывается на самоубийство такой клетки. Система очень четко работает. Более-менее понятны взаимодействия в ней.

Вторая система, о которой пойдет речь, так называемые стволовые клетки. Сегодня они тоже на слуху, работы ведутся во всем мире, с ними связывают большие надежды в заменительной терапии (замена поврежденных тканей, органов и так далее). Стволовые клетки бывают двух типов, эмбриональные и обычные. Они недифференцированные, могут давать ткани различных органов, особенно эмбриональные — из них может вырасти любая ткань. Сегодня наиболее изучены стволовые клетки костного мозга — это вся кроветворная система; нервных тканей (целый ряд заболеваний, таких как Альцгеймера, Паркинсона и ряд других); сердечная мышца и островковые клетки поджелудочной железы — диабет. Наиболее интересные результаты получены по этим направлениям. Расскажу о двух работах института.

Доктором С.Закияном получено более 10 линий эмбриональных стволовых клеток полевок, которые уже прошли много пассажей.

Доктором О.Серовым показано, что при слиянии эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток, при прохождении целого ряда клеточных делений заканчивается все тем, что хромосомы из дифференцированных клеток выбрасываются, элиминируются. Остаются в конечном итоге только хромосомы из эмбриональных стволовых клеток. Данное явление названо хромосомной памятью. То есть, статус дифференцировки клеток в хромосомах записан, и несовместимость хромосом эмбриональной и дифференцированной клетки заключается в том, что чем глубже клетка прошла дифференцировку, тем быстрее элиминируются эти хромосомы.

Открытое явление наводит на мысль, что следует пересмотреть стратегию клонирования. Ведь при клонировании мы имеем огромный брак — из сотен попыток лишь отдельные успешные случаи. Наверное, трудности в клонировании могут быть связаны и с тем, что следует брать для клонирования ядра или эмбриональных стволовых клеток, или просто стволовых клеток, или мало дифференцированных клеток. То есть, статус дифференцировки влияет на процессы клонирования. И есть возможность внести некоторые коррективы в эту технологию.

Следующая проблема — трансгенез. Сегодня осуществляется очередная биологическая революция. Была "зеленая революция", которая позволила удвоить продовольственный потенциал планеты, и ее создатель Норман Борлауг получил Нобелевскую премию. Сейчас идет биотехнологическая или геноинженерная революция. И в ее основе, прежде всего, лежат методы трансгенеза у растений и животных. Трансгенез — это технология переноса в геном растений и животных чужих генов.

Возьмем агробактерию. Как мы пришли к трансгенезу? Когда расшифровали, каким образом у растений появляются опухолевые образования, так называемые корончатые галы, стало ясно, что за этим большое будущие в чисто технологическом плане. Было показано, что у агробактерии есть плазмида, кольцевая ДНК, которая переносится в геном растений, вызывает опухоль, и опухоль начинает работать, производя питательные вещества для бактерии.

Исследователи обхитрили агробактерию, оставили в ней только транспортную зону, вырезали опухолевую часть, все гены, определяющие опухоль, и вместо них начали подставлять векторные системы с теми генами, которые нам нужны. Таким образом и плазмида, и агробактерия начали работать уже на получение трансгенных растений. Сегодня у 120 видов растений получены трансгенные формы. По последним данным в мире 60 млн га занято под трансгенными растениями, что составляет половину посевных площадей России.

Во многих лабораториях мира ведутся сейчас работы по получению съедобных вакцин. В растение переносятся гены, которые работают, как антигены: гены оболочки бактерии туберкулеза, гены вирусов гепатита и так далее. В настоящее время поставлен вопрос о том, чтобы по большинству инфекционных заболеваний создать так называемые съедобные растительные вакцины, ввести в растения гены этих возбудителей, с тем, чтобы проводить в будущем тотальную вакцинацию против целого ряда заболеваний (туберкулеза, гепатита, СПИДа и так далее). Такие работы развернуты, есть специальная программа, в которой задействованы Институт цитологии и генетики, Институт биоорганической химии, ГНЦВБ "Вектор", Институт физиологии и биохимии растений в Иркутске.

Перспективные работы ведутся с животными. Самое значительное в практическом плане — под промотерами генов молока подставлены гены, которые нарабатывают биологически активные вещества. Таким образом уже получают антитрипсин, антитромбин, белок С, альбумин человека.

И еще несколько слов о проблеме трансгенеза. Начну вот с чего. На обложке журнала "Фармакологическая наука" на двойной спирали ДНК обозначена мышка. Мышь — объект уникальный. Во-первых, полностью расшифрован ее геном. Оказалось, что у нее 2,5 млрд нуклеотидов, у человека — 2,9 млрд. У мыши — 30 тысяч генов, у нас где-то — 35 тысяч. Но 80% генов у мыши и человека гомологичны, то есть, почти одинаковы. Поэтому мышь — прекрасная модель для изучения многих процессов и механизмов, особенно патологических.

Совместными работами проф. Н.Поповой из нашего Института цитологии и генетики и сотрудников Института Кюри во Франции получены так называемые нокаутные линии мышей — линии, где заблокирован, выбит какой-то ген. Есть такая модель, где изучается ген МАО, который регулирует эмоции, поведение, реакцию на стресс. Если заблокировать ген, то в мозге увеличится уровень серотонина и норадреналина, что ведет к повышению агрессивности, асоциальному поведению, слабоумию. Появляется целый ряд других отрицательных моментов. Точно такая же патология найдена у человека. Это так называемое "голландское семейство", где четко показано, что блок данного гена вызывает резкую агрессивность и слабоумие.

Назову еще одну работу, выполненную в лаборатории И.Жимулева. Одна из главных проблем в трансгенезе — экспрессия генов. Нет проблемы перенести любой ген человека в растение, растительный ген — животным и так далее. Но здесь существуют сложности. В частности, чтобы ген работал активно, необходима экспрессия гена, достичь ее довольно трудно. Но, у дрожжей выделена UAS-система, которая может увеличить экспрессию гена в тысячу раз. Есть надежда, что, вводя систему и в растения, и в животных, можно получить суперэкспрессию отдельных генов. И.Жимулевым показана работа системы на дрозофиле.

Сегодня на UAS-систему возлагают большие надежды в том плане, что она позволит получать суперпродуценты по определенным продуктам генов. Эти гены будут работать в сотни, а то и в тысячи раз более активно, чем в обычном порядке.

И последнее. Разработаны цитологические методы, которые позволяют узнавать каждую хромосому в лицо. Последние работы Н.Рубцова показывают, что можно даже фиксировать небольшие инверсии, то есть, перевороты отдельных участков хромосом на 180 градусов. Сегодня можно в цитогенетическом плане контролировать фактически все процессы, которые проходят на хромосомном уровне и выявлять все патологии, которые с этим связаны.

Наши предшественники, учителя всегда говорили: смотрите на всю фактуру сверху, с эволюционно-популяционных позиций. Все укладывается в знаменитую дарвиновскую триаду — наследственность, изменчивость и отбор. Наследственность, это стабильность, сохранение видов из поколения в поколение. Изменчивость — возможность выбора. Отбор, сохранение наиболее приспособленных и адаптированных к определенным условиям организмов. Все, в конце концов, выходит на эту триаду, на эти три карты. Они решают все, осуществляют эволюцию, и в конечном итоге — жизнь.

стр. 4-5