«МОЛЧАЩАЯ» ДНК ГЕТЕРОХРОМАТИНА
Cегодня по объему накапливаемой информации и свершившихся
открытий никакая другая область знаний не может, пожалуй,
сравниться с молекулярной генетикой. Здесь много «зон», изучение
которых уже дало и готовит в будущем «много нам открытий чудных».
Экспрессия генов — одно из направлений, особенно будоражащих умы
специалистов. Каждый новый факт из «жизни» гена дает пищу для
размышлений и открывает увлекательные перспективы. С доктором
биологических наук Алексеем Груздевым, главным научным
сотрудником Института цитологии и генетики СО РАН, наш
корреспондент Л. Юдина беседует о «молчащей» ДНК гетерохроматина.
— Алексей Дмитриевич, как можно сформулировать тему ваших
исследований?
— Определение топологического состояния ДНК в ядрах и
хромосомах.
Начну с ДНК, ядер и хромосом. Много времени прошло с тех пор, как
в ядрах клеток была обнаружена ДНК. Сейчас всем известна модель
молекулы ДНК в виде двойной спирали, предложенная Уотсоном и
Криком 50 лет тому назад. Стоит ли объяснять, какое значение для
науки имела эта модель? Сразу стало ясно, что надо делать дальше.
Прежде всего, следовало понять информационные свойства ДНК
(генетический код), потом выяснить структуру генов, молекулярные
механизмы считывания информации (транскрипции) и, конечно,
механизмы воспроизведения (репликации) ДНК. Были привлечены
разнообразные физические и разработаны новые молекулярные методы.
Полученные результаты зачастую поражали (и сейчас поражают)
воображение.
Одновременно решались задачи структурной организации ДНК в
хромосомах. Было установлено, что каждая хромосома содержит одну
молекулу ДНК, упакованную на нескольких уровнях. На ней имеются
многочисленные сайты прикрепления к ядерному матриксу. Поэтому в
ядре ДНК видна как нить, образующая длинные петли. Но петли ДНК
упакованы на трех уровнях. На первом уровне с ДНК связываются
белковые глобулы, на каждую из которых накручивается по два витка
молекулы ДНК. Цепочка образовавшихся таким образом нуклеосом
выглядит как бусины на нитке. На втором уровне эта цепочка
укладывается в толстую фибриллу, а затем, на третьем уровне, в
хромомер. В световой микроскоп хромомеры интерфазного ядра обычно
не видны. Зато в делящихся клетках отлично видны хромосомы,
построенные из хромомеров.
В неделящихся, интерфазных клетках хромосомы деконденсированы.
Транскрипционно неактивные гены остаются в них в виде плотных
хромомеров, а ДНК транскрипционно активных генов «выпетлена». С
нею связываются многочисленные ферменты, обеспечивающие
транскрипцию.
— Вы сказали, что в ядрах большинства организмов ни хромомеры,
ни транскрипционно активные петли ДНК не видны в микроскопе. Как
быть?
— Природа создала удивительно большие хромосомы, которые
наглядно демонстрируют, какие гены (точнее — участки хромосом)
активны, а какие нет. Эти хромосомы называются политенными
(многонитчатыми), потому что образуются из обычных хромосом в
результате многократного удвоения нитей ДНК, причем все
получившиеся копии (до 10 тысяч) лежат бок о бок друг с другом.
Такие хромосомы легко наблюдать в интерфазных ядрах некоторых
тканей личинок мух и комаров. Хорошо известны, например,
политенные хромосомы плодовой мушки дрозофилы, излюбленного
объекта генетиков. Под микроскопом они видны как длинные (порядка
100 микронов) и толстые (несколько микронов) поперечно
исчерченные цилиндры. В плотных дисках находятся неактивные гены,
в светлых, часто видимых как вздутия — активные.
Здесь надо заметить, что в хромосомах еще имеются участки так
называемого гетерохроматина. Его свойства во многом отличны от
свойств эухроматина, к которому относятся ДНК всех активных и
потенциально активных генов. Цитолог Хейц в 1937 году обратил
внимание на плотные глыбки хроматина, которые он обнаружил в
ядрах и назвал их гетерохроматином (другим хроматином). В
гетерохроматине, как было показано впоследствии, подавлена
транскрипция, репликация ДНК в них происходит позже обычного и, к
тому же, глыбки склонны слипаться друг с другом. Гетерохроматин
практически не содержит нормальных генов, а в тех генах, которые
попадают в гетерохроматин в результате перестроек хромосом,
транскрипция замолкает. Гетерохроматин отличается от эухроматина
также по составу ДНК — он обогащен повторами и мобильными
генетическими элементами. Иными словами, гетерохроматин кажется
ненужным или просто запасным генетическим материалом. Но это не
так. Укажу лишь одну его важную функцию. Если бы в хромосомах не
было «балластного» гетерохроматина, то при любой перестройке
хромосом нарушалась бы целостность гена, разорванного
перестройкой. Отсюда — ухудшение или полная потеря функции
данного гена. По этой причине, как давно обнаружено, концы
большинства наблюдаемых хромосомных перестроек находятся в
гетерохроматине. В России гетерохроматину посвящены две
фундаментальные монографии. Первая написана в 1986 году
выдающимся цитологом А. Прокофьевой-Бельговской, а вторая — в
1993 году членом-корреспондентом РАН И. Жимулевым из нашего
института.
— Какое можно дать резюме?
— Хроматин клеточного ядра находится в трех формах:
транскрипционно активной, транскрипционно неактивной и в форме
гетерохроматина.
— Тогда поясните, какова связь между формами хроматина и
топологией ДНК.
— Топология — область математики, которая занимается проблемами
непрерывности и разрывности. В ней исследуются, в частности,
такие свойства фигур, которые не изменяются при любых деформациях
кроме разрывов и склеиваний. Так у сферы, очевидно, есть 2
поверхности и нет (0) краев, а у листа есть уже не только 2
поверхности, но еще 1 край. Если же лист свернуть в трубочку и
склеить(!), то у него будет уже 2 стороны и 2 края. Длинный лист
(лента) может служить топологической моделью молекулы ДНК, только
для полноты восприятия ленту надо скрутить, т.е. закрутить края
ленты вокруг ее оси. Именно таким обычно представлено
схематическое изображение ДНК в учебниках. Очевидно, что
скрученная (деформированная) лента остается топологически
эквивалентной листу — в ней 2 поверхности и 1 край. Однако после
склеивания концов ленты у нее не только увеличивается число краев
до 2, но и появляется новая топологическая характеристика — число
зацеплений, т.е. число витков, которое делает один край
ленты вокруг другого. Назовем такую ленту топологически
замкнутой, а не склеенную — разомкнутой.
Теперь вернемся к ДНК. Сейчас установлено, что молекулы ДНК всех
организмов, как правило, замкнуты. В плазмидах, вирусах и фагах
они обычно имеют форму колец, а в ядрах животных и растений петли
ДНК прочно замкнуты связями с ядерным матриксом. При изменении
упаковки, а также в процессе функционирования ДНК в ней могут
возникать торсионные (скручивающие) напряжения. Но в клетке
существуют ферменты, способные как создавать, так и релаксировать
эти напряжения.
В каких же физических, а следовательно, топологических состояниях
находятся ДНК каждой из трех различных форм хроматина — в
замкнутом без напряжения (релаксированном), в замкнутом торсионно
напряженном или в топологически разомкнутом? Для ответа на этот
вопрос нами был разработан микрофлуориметрический метод,
позволяющий измерять относительные количества замкнутых форм ДНК
в небольших участках ядер или хромосом.
— Хотелось бы, чтобы вы продемонстрировали преимущества метода.
— Используя гигантские политенные хромосомы личинок одного из
видов комаров, мы убедились, что ДНК в транскрипционно неактивных
дисках, как и ожидалось, находится в топологически замкнутом
релаксированном состоянии. Мы подтвердили также, что в
транскрипционно активных участках (пуфах) ДНК существенно
недокручена (т. е. торсионно напряжена отрицательно).
По-видимому, это регулируемое клеткой состояние ДНК обеспечивает
оптимальную скорость транскрипции генов.
Наш метод оказался недостаточно чувствительным для исследования
состояния ДНК в отдельных участках метафазных хромосом мыши.
Поэтому мы исследовали большие скопления хромосом. К нашему
удивлению оказалось, что почти вся (80%) ДНК этих хромосом так же
торсионно напряжена, как ДНК транскрипционно активных генов в
пуфах политенных хромосом, но заметно устойчива к ДНКазам
(ферментам, расщепляющим ДНК). Вероятнее всего, напряжение
возникло при уплотнении упаковки ДНК в тело хромосомы. Этот вывод
был подтвержден группой японских исследователей. Позже ими был
вскрыт и механизм возникновения напряжения.
Мы также проследили изменения в замкнутой ДНК хромосом после
деления клетки во время формирования дочерних интерфазных ядер.
Оказалось, что у большей части ДНК торсионное напряжение
исчезало, а чувствительность к ДНКазам увеличилась незначительно.
У меньшей части молекул ДНК напряжение сохранялось, но они
становились высоко чувствительными к ДНКазам. Несомненно, что эти
две фракции соответствуют неактивному и активному хроматинам.
Остальные 20% всей ДНК и в хромосомах, и в интерфазных ядрах были
практически устойчивыми к ДНКазам. Эта ДНК могла быть либо
недоступной ферментам потому, что она чрезвычайно плотно
упакована в хромосомах и ядрах, либо, в отличие от основной ДНК,
быть топологически разомкнутой. Вспомним, что в интерфазном ядре
наибольшей плотностью упаковки отличается гетерохроматин. Может
быть, именно его ДНК не только плотно упакована, но и
топологически разомкнута?
— Удалось дать ответ на поставленный вопрос?
— Чтобы решить задачу, использовали политенные хромосомы,
которые имеют четкие блоки гетерохроматина и измерили в них
содержание топологически замкнутых ДНК. Результаты измерений
показали, что оно не превышает 10%. Иными словами, почти вся
(90%) ДНК этих блоков топологически разомкнута и, по-видимому,
содержит разрывы. Этот результат было нетрудно проверить. После
обработки хромосом лигазами (ферментами, сшивающими концы
разрывов ДНК) все молекулы ДНК гетерохроматиновых блоков
оказались топологически замкнутыми. Факт существования в клетках
ДНК с разрывами был совершенно неожиданным. Ведь до сих пор
считалось, что любой разрыв ДНК должен быть «залечен», иначе
клетка погибнет. Кроме того, считалось установленным, что
транскрипционная инертность гетерохроматина вызвана прежде всего
химическими модификациями некоторых оснований его ДНК, а также
плотной упаковкой ДНК специфическими белками. Не исключено,
однако, что топологическая разомкнутость молекул ДНК является
важнейшим фактором инертности гетерохроматина. Ведь в разомкнутой
ДНК невозможно появление торсионного напряжения, поддерживаемого
в ДНК активных генов. Отсюда становится понятным также, почему
замолкает ген, попавший в гетерохроматин в результате хромосомной
перестройки. Кроме того, наличие разрывов ДНК позволяет просто
объяснить многие специфические особенности гетерохроматина, в
частности, перечисленные выше. Ну, например, плотную упаковку в
нем ДНК.
— Алексей Дмитриевич, как бы это сказать попонятнее?
— У вас есть сад?
— Имеется!
— Возьмите шланг для полива и попробуйте намотать его на руку
начиная со свободного конца. Если другой конец шланга присоединен
к трубе, то вам это до конца не удастся — между вами и трубой
будут накапливаться витки обратного направления. Если же второй
конец свободен, то он прокручивается без образования
противовитков. То есть вы можете намотать шланг до конца.
Примерно так же с ДНК. Если в ней есть хотя бы один разрыв
хотя бы в одной из двух нитей, то ее можно упаковать предельно плотно.
— Еще вопрос. Вы говорили, что глыбки гетерохроматина слипаются
в ядре. Почему?
— А вы представьте, что две глыбки случайно оказались рядом.
Если встретятся концы разрывов двух молекул ДНК с одинаковыми
последовательностями оснований, то они могут «склеиться», и в
последующем раунде репликации дадут гибридные молекулы,
принадлежащие одновременно обеим глыбкам. Видимо поэтому
перестройки хромосом происходят чаще всего в гетерохроматиновых
райнах.
— Алексей Дмитриевич, давайте конкретизируем, что вам удалось
внести в данную проблему — ведь о гетерохроматине было известно
и ранее?
— Мы впервые показали, что в ядрах и хромосомах
есть молекулы ДНК с перманентно существующими разрывами. Это дало
нам возможность объяснить с единой точки зрения многие
особенности загадочной компоненты клеточного ядра — гетерохроматина.
стр. 6
|
