В СТРАНЕ ХРОМОСОМ
И ХРОМОСОМНЫХ ТЕРРИТОРИЙ
Современные технологии молекулярно-цитогенетического анализа
хромосомных патологий человека позволяют приблизиться к разгадке
многих наследственных и врожденных заболеваний человека. Их
результатом также являются новые более надежные и чувствительные
методы медицинской диагностики.
Л. Юдина, «НВС»
 |
| Д.б.н. Н. Рубцов и к.б.н. С. Байбородин у лазерного сканирующего микроскопа.
|
Лаборатория морфологии и функции клеточных структур Института
цитологии и генетики СО РАН, которой руководит доктор
биологических наук Николай Рубцов, накопила по разным аспектам
хромосомной тематики богатейший материал. Если до середины
девяностых основное внимание исследователи уделяли
морфологическому анализу хромосом, то сейчас научились
анализировать их молекулярный состав, выделять и размножать ДНК
из интересующих районов хромосом. Это позволило лаборатории
создать большой набор хромосомо- и районоспецифических ДНК-проб,
которые используются как эффективный инструмент в последующих
исследованиях. Сегодня они вплотную подошли к решению вопроса о
механизмах хромосомных нарушений, разработали ряд новых методов
анализа хромосомных аномалий.
Новые возможности в проведении сложнейших, тонких, иной раз почти
фантастических (в буквальном смысле слова) исследований дает
приобретение Институтом цитологии и генетики СО РАН самой
современной микроскопической техники. Так, в 2005 году был
приобретен лазерный сканирующий микроскоп нового поколения,
возможности которого впечатляют даже специалистов. В декабре
микроскоп был установлен в Центре коллективного пользования
микроскопического анализа биологических объектов СО РАН,
созданного на базе лаборатории морфологии и функции клеточных
структур ИЦиГ. К настоящему времени уже несколько лабораторий
успело воспользоваться новыми возможностями, открывшимися
благодаря появлению в СО РАН принципиально новой микроскопической
техники.
— Николай Борисович, сбылась ваша давняя мечта, и теперь
лаборатория сможет перейти на другой уровень исследований?
— Достаточно часто принципиальные прорывы в биологии связаны с
появлением новых методов анализа и соответствующей им новой
приборной базы. Это можно заметить, если проследить за развитием
методов микроскопического анализа. Лет 20-25 назад в биологии
при световой микроскопии в основном использовали обычные
красители. Наши возможности качественно изменились с разработкой
методов, позволяющих специфично окрашивать конкретные белки,
участки хромосом, содержащие интересующие нас фрагменты ДНК. Эти
методы потребовали нового типа микроскопии, и она была
создана — люминесцентная микроскопия. Необходимость одновременного анализа
большого числа объектов поставила новые задачи, решение которых
привело к появлению цифровой и компьютерной микроскопии.
Например, в 1996 году были разработаны методы, позволяющие
окрашивать в одной клетке материал каждой хромосомы человека в
свой цвет. Развитие этих методов имело и имеет огромное значение
не только для биологии, но и для медицины. Однако, оставался один
большой разрыв между реальной жизнью и возможностями световой
микроскопии: изображение любого объекта регистрировалось в виде
двумерной картинки, а мир, в котором мы живем, и большинство
изучаемых объектов являются трехмерными. Более того, есть еще и
время — четвертое измерение. То есть, надо признать, что для
полноценного решения большого круга задач нам необходима трех-
или даже четырехмерная микроскопия. Возможности проведения такой
микроскопии и отрыло для нас приобретение одного из самых
современных лазерных сканирующих микроскопов — LSM 510 META
фирмы «Карл Цейсс».
— У нее намного больше преимуществ?
— Говоря о преимуществах, вероятно, стоит рассмотреть их
отдельно.
Первое — лазерная сканирующая или конфокальная микроскопия
позволяет резко повысить качество микроскопии при работе с
«толстыми» образцами и срезами. При толщине анализируемого
объекта не более 0,3 микрона конфокальная микроскопия не имеет
особых преимуществ. Но обычно мы имеем дело со значительно более
«толстыми» объектами. То же можно сказать и про срезы, которые
готовят для световой микроскопии. В этих случаях изображение,
полученное с помощью обычной световой микроскопии, будет сильно
«испорчено» сигналами, пришедшими из-за пределов фокальной
плоскости. Проще говоря, вместо ясного изображения объекта мы
увидим его в густом тумане. Конфокальная микроскопия позволяет
нам регистрировать сигналы, идущие только из фокальной плоскости.
Т.е., несмотря на «толщину» объекта, изображение останется четким
и ясным.
Второе — с лазерной сканирующей микроскопией мы имеем
возможность получить не просто изображение одного оптического
среза, но набора таких срезов с очень небольшим сдвигом от одного
к другому. У нашего микроскопа минимально возможный шаг равен
0,000005 миллиметра. То есть, мы получаем очень детальную
информацию о трехмерной организации изучаемого образца.
Компьютерная обработка полученной информации позволяет построить
его подробную трехмерную модель. Это принципиально новые
возможности, которые в обычной микроскопии отсутствуют.
Третье — так как конфокальная микроскопия позволяет получать
изображение оптических срезов, то она не требует физической резки
образца. В то же время, у исследователей есть возможность
пометить в живой клетке конкретные интересующие их белки или
районы хромосом. Это значит, что в нашем распоряжении появились
методы, дающие возможность следить за синтезом и перемещением в
живой клетке интересующих нас молекул. То, что еще недавно
казалось элементами научной фантастики, теперь стало реальностью.
Четвертое — кроме регистрации образа исследуемого объекта,
лазерная сканирующая микроскопия позволяет воздействовать на
флуоресцирующую часть изучаемых белков (продуктов специальных
генных конструкций) в отдельных, очень небольших, районах клетки
или клеточного ядра. Значит, можно оценить подвижность белков в
клетке и константы реакций, в которых участвуют эти белки.
Пятое, шестое и так далее, вероятно, слишком специально и
утомительно. Оставим это на будущие встречи.
Если вернуться к исследованиям нашей лаборатории или к работам,
ведущимся в лабораториях чл.-корр. РАН И. Жимулева, д.б.н.
А. Графодатского с хромосомами человека и некоторых видов животных,
надо отметить, что раньше мы были вынуждены хромосомы
«распластывать» тонким слоем на поверхности стекла и лишь затем
приступать к их анализу. Исследователь всегда должен учитывать,
что воздействие на объект исследования меняет его. Чем меньше
воздействие, тем проще понять полученные результаты. Сейчас
появились возможности значительно уменьшить воздействия на
объект, а следовательно, и его изменения. Если раньше мы могли
очень надежно определять состав индивидуальных районов хромосом,
менее надежно — их состояние, то сейчас неизмеримо выросли наши
возможности и в изучении состояния отдельных хромосомных районов,
появились принципиально новые возможности определения их
положения и взаиморасположения в клеточном ядре. Более того,
появилась возможность практически прямого анализа уровня
активности генов в зависимости от локализации в клеточном ядре
содержащего их хромосомного района.
С новым лазерным сканирующим микроскопом мы сможем анализировать
и изучать хромосому и ее поведение в реальной жизни: как она
взаимодействует с другими клеточными элементами, где и как
располагаются разные ее районы, активно работающие и молчащие в
данный момент. Реально это принципиально новый уровень
исследований в молекулярной и клеточной биологии.
— Получается, что без такого прибора вам никак нельзя! Ну, а
если бы вы его не получили (все могло случиться!)?
— Пока мы его не имели, были вынуждены выполнять часть
исследований далеко от Новосибирска. Так, сотрудница нашей
лаборатории к.б.н. Т. Карамышева в прошлом и позапрошлом годах
работала по три месяца в Мюнхене в замечательной лаборатории
Томаса Кремера, одной из лучших лабораторий мира, изучающих
принципы трехмерной организации интерфазного ядра. Сотрудник
лаборатории чл.-корр. РАН И. Жимулева к.б.н. В. Шлома выполнил
ряд исследований в Подмосковье, в институте, где лазерный
сканирующий микроскоп появился несколько раньше, чем у нас.
К.б.н. Л. Захаренко из лаборатории д.б.н. И. Захарова съездила в
Канаду. Для некоторых наших лабораторий исследования с
использованием лазерного сканирующего микроскопа проводили их
зарубежные коллеги. Естественно, мы боремся за свои позиции в
мировой науке в любой, даже неблагоприятной ситуации. Однако,
если бы мы остались в такой зависимости от наших коллег из других
частей света, то через несколько лет, безусловно, потеряли бы ряд
своих позиций и оказались бы в отстающих. Для нас был бы
практически закрыт целый пласт работ, в том числе очень важные
направления.
— Но, Николай Борисович, и без этого оборудования вы выполняли
работы высокого класса!
— Мы вынуждены были работать в тех направлениях, в которых
позволяла техника, или, как я уже отметил, ездить для выполнения
небольших фрагментов работы за тысячи километров. И в этой
ситуации мы добились довольно многого. Разработали метод создания
ДНК-проб с помощью микродиссекции хромосом. Внесли свой вклад в
разработку новых методов флуоресцентной in situ гибридизации с
использованием таких ДНК-проб, частично совместно с нашими
зарубежными коллегами, частично в России. Разработка этих методов
дала немало развитию диагностики хромосомных патологий человека.
Разумеется, любую из проблем можно пытаться решить разными
способами. Но ограниченные возможности обязательно проявятся на
конечном результате. Даже в случае успеха может оказаться, что
вам потребовалось слишком много времени, и полученный результат
уже не имеет смысла. Возможно и другое: научное сообщество
откажется его принять, считая, что строгое доказательство требует
более современных и надежных методов анализа. Некоторые положения
сейчас бесполезно пытаться доказывать, если в работе используется
обычная, а не конфокальная микроскопия. Солидные журналы просто
откажутся публиковать ваши результаты.
— Главный ориентир работ лаборатории — здоровье человека?
— В конечном итоге. К сожалению, путь к реальной и эффективной
медицине долгий и многотрудный, но начинается он, как правило, в
научной лаборатории. Здесь выясняются причины заболеваний,
разрабатываются новые методы диагностики. Последнее относится и к
нам. Создание новых методов анализа хромосомных патологий входит
в круг наших задач.
— На сегодня у вас есть, что предложить практикующим медикам?
— У нас есть разработки, которые бы могли пригодиться
практической медицине. Более того, они апробированы в нашей
лаборатории. К сожалению, их применение требует наличия в
медицинских диагностических центрах оборудования и реактивов,
которых сейчас там нет. Поэтому наши коллеги из
медико-генетических консультаций различных городов России время
от времени обращаются к нам с просьбой провести анализ
хромосомных патологий у конкретных пациентов.
С другой стороны, современные молекулярно-цитогенетические методы
диагностики достаточно дороги по затратам на реактивы и
трудоемки. За рубежом, например, эффективно действует страховая
медицина, способная оплатить большую часть диагностических и
лечебных расходов. У нас пока (очень бы хотелось надеяться, что
пока) ситуация иная. Реально страховая медицина обеспечивает
сегодня оплату только простейших процедур и анализов. За все, что
делается сверх того, больной должен рассчитываться сам. А
поскольку финансовые возможности большинства населения страны
этого не позволяют, перспективы широкого внедрения наших
разработок в практическую медицину не внушают оптимизма.
Есть и другие проблемы. Предположим, необходимое оборудование
будет закуплено, выделены деньги на расходные материалы. Надо
обеспечить эффективное использование созданных возможностей для
проведения диагностики на новом уровне. Ведь если будут
выполняться 2-3 анализа в месяц, приобретение дорогостоящих
приборов себя не оправдает. Очевидно, следует не только создавать
сеть специализированных диагностических центров, но и проводить
соответствующую подготовку или переподготовку врачей, работающих
в обычных клиниках и лабораториях. Необходимо, чтобы они были
осведомлены о новых возможностях современной диагностики, знали,
куда и когда нужно направить пациента. В Сибирском отделении,
например, создан Центр новых медицинских технологий, который
может обеспечить проведение некоторых типов современной
диагностики на достаточно высоком уровне. В настоящее время
делаются попытки привлечь нас к деятельности этого Центра.
— Ваша реакция? Соглашаетесь?
— Вопрос не самый простой. Насколько активно мы будем
сотрудничать с Центром, зависит от многого. Возможности
лаборатории не безграничны. Чтобы всерьез включиться в проведение
повседневной диагностики, потребуется привлечь новых людей,
обучить их. В противном случае придется отказаться от каких-то из
наших работ. Так что, пока думаем, как с меньшими потерями для
наших исследований решить эти вопросы.
— Николай Борисович, все-таки интересно узнать, какие
хромосомные перестройки влияют на состояние нашего здоровья?
Легко ли их распознать и возможно ли при необходимости
нежелательные из них устранить?
— Вариантов хромосомных перестроек довольно много. Идентификация
некоторых из них не представляет больших проблем, выявление и
верификация других требуют применения специальных методов.
Некоторые хромосомные аномалии приводят к очень печальным
последствиям, другие никак не сказываются на человеке — их
носителе — и могут передаваться в семье в нескольких поколениях. С
некоторыми хромосомными перестройками все понятно, например,
несбалансированными транслокациями хромосом. С другими, такими
как малые сверхчисленные маркерные хромосомы, все очень непросто.
Сейчас мы стараемся разделить сверхчисленные маркерные хромосомы
на «вредные» и «безвредные». Тогда при дородовой диагностике
можно будет делать более надежный прогноз, который бы облегчил
родителям принятие очень непростого решения.
— Но в чем смысл признания факта, что у родившегося человека
уже с хромосомами что-то там не так? Исправить ведь ничего
нельзя?
— Это не совсем так. Да, избавить пациента от хромосомной
патологии невозможно, но, зная, к каким аномалиям развития
приводит такая перестройка, можно принять превентивные меры,
чтобы уменьшить ее негативное влияние. Конечно, это непросто и
успех не гарантирован. Но можно все-таки сказать — информирован,
значит вооружен.
— На чем же сегодня строится медицинская генетика?
— Основа медицинской генетики сегодня — диагностика
наследственных и врожденных нарушений, выяснение их значения для
пациента и его потомков и, как следствие, прогноз на будущее, а
также разработка методов коррекции выявленных нарушений.
Очевидно, что огромное значение имеет проведение диагностики еще
до появления у пациентов серьезных проблем. Например, выявление
сбалансированной транслокации хромосом у родителей указывает на
необходимость проведения пренатальной (дородовой) диагностики у
их ребенка, что позволит со 100 % надежностью определить, нет ли
у ребенка несбалансированной транслокации. Сегодня существуют
методы выявления численных хромосомных аномалий еще до
имплантации, что очень актуально при экстракорпоральном
оплодотворении.
Заметим, что чем точнее диагностика, тем надежнее прогноз, тем
лучше может быть подобран вариант коррекции. С генными мутациями
несколько проще. В ряде случаев хорошие результаты дает просто
использование определенной диеты. Ведутся, и небезуспешно, работы
по генной терапии, когда в некоторые клетки организма вводятся
гены, выполняющие функции поврежденного гена. С хромосомными
патологиями проблем больше, потому что они обычно затрагивают
большое число генов.
— Как-то слушала ваше выступление, где речь шла о возможностях
определять онкологических больных именно по хромосомным
перестройкам. Насколько это реально сегодня?
— В биологии всегда очень много вариантов. Есть хромосомные
перестройки, следствием которых является очень высокая
вероятность возникновения онкологического заболевания. Примером
может служить делеция в коротком плече хромосомы-3 человека.
Однако, вопрос, является ли онкологическое заболевание следствием
хромосомной перестройки, или, наоборот, должен рассматриваться
индивидуально в каждом отдельном случае. Перестройка может не
обязательно вести к онкологии, но модифицировать вариант
трансформации клеток, делая уже существующее заболевание более
тяжелым. При диагностике разных вариантов онкологических
заболеваний необходимо учитывать морфологию клеток, их
иммунологический статус и хромосомные перестройки. Часто такие
комплексные исследования абсолютно необходимы, ибо при одной и
той же морфологии и иммунологическом статусе возможны различные
варианты заболеваний, требующие различного лечения. Только при
проведении полной диагностики можно сделать однозначный вывод и
выбрать оптимальное лечение. Стоит заметить, что проведение
хромосомного анализа часто позволяет также следить за
эффективностью выбранной терапии.
— Все-таки хочу уточнить, есть ли хромосомные перестройки,
характерные для определенного типа заболевания?
— Если говорить об онкологии, то «да». Но в то же время подобные
заболевания могут иногда возникать и протекать и при отсутствии
таких перестроек. И наоборот, «характерные перестройки» могут
возникать в случае других онкологических заболеваний.
Что такое раковая клетка? Нормальная клетка способна делиться
конечное число раз. Это одна из причин, почему живое существо не
может жить вечно. Клеточная трансформация может привести к снятию
ограничений на число делений. В этом случае клетка приобретает
способность делиться бесконечно. Если она способна делать это в
организме, выйдя из под его контроля, то возникает онкологическое
заболевание. Такие клетки несколько отличаются от нормальных. В
принципе, организм может их «увидеть» и уничтожить. К сожалению,
такие клетки очень быстро меняются, уходя от защитной реакции
организма. Некоторые изменения связаны с возникновением новых
хромосомных перестроек. Поэтому хромосомный анализ при
онкологических заболеваниях часто является необходимым элементом
контроля за ситуацией.
— Можно ли надеяться, что сейчас, когда секвенирован геном
человека и известны все гены, проще будет решать проблемы,
связанные со здоровьем человека?
— Несомненно. Но хотелось бы заметить, что секвенирован — не
значит прочитан, и далеко не все гены известны. Известна
последовательность нуклеотидов в ДНК человека (хотя я полагаю,
что это утверждение слишком оптимистично). Однако, смысл понятен
только для 2-3 % того, что секвенировано. Есть, правда, и
несколько более оптимистичные оценки. Тем не менее, к настоящему
времени выявлено множество генов, нарушения в работе которых
приводят к разным нежелательным явлениям. Есть в нашем организме
так называемые онкогены, гены-супрессоры опухолевого роста. Чем
больше мы знаем о механизмах их работы, тем больше у нас
появляется возможностей исправить возникшие в организме
нарушения.
— И все-таки, как вы оцениваете секвенирование генома человека?
— Это великое событие. Оно дало огромный толчок развитию работ в
самых разных областях биологии. Но сколько еще предстоит узнать!
Взаимодействие между генами, регуляция их активности — это
отдельный и, пожалуй, самый острый вопрос. Мы говорили о двух-,
трех- и четырехмерной микроскопии. Я думаю, что секвенирование
генома — это лишь первый одномерный вариант его изучения.
Действительно, секвенирование дало лишь последовательность
нуклеотидов, записанных в одну строчку. Точнее в 24 строчки
(22 аутосомы и хромосомы X и Y). Однако, в клетке ДНК представляет собой не
растянутую нитку, а сложно организованную трехмерную структуру,
которая меняется в процессе дифференцировки клетки. Уже ясно, что
правильное управление геном возможно лишь, если он находится в
ядре в правильном месте. Он должен занять в хромосомной
территории определенное положение, соответствующее место. То
есть, чтобы система работала, хромосома должна временами менять
свою пространственную организацию.
— Николай Борисович, задач у вас множество. Но можно ли выделить
такие, решение которых представляет для лаборатории морфологии и
функции клеточных структур особую ценность?
— Нас давно интересует пространственная организация хромосомы и
связь с ней регуляции активности генов. Мы полагаем, что
некоторые наши результаты имеют большое значение для широкого
круга исследователей. К сожалению, сильно мешало отсутствие
соответствующей приборной базы. С появлением конфокального
микроскопа появились хорошие шансы более
плотно заняться пространственной организацией хромосомной
территории, ее ролью в регуляции активности генов.
В настоящее время уже выявлены некоторые закономерности взаимного
расположения в ядре целых хромосом. Очень впечатляющие работы в
этой области выполнены в лаборатории Томаса Кремера. Нам бы
хотелось понять, как организована индивидуальная хромосомная
территория, каким образом происходит ее реорганизация в клеточном
цикле. Другая очень интересная проблема — эволюция хромосом.
Почему отличаются хромосомы разных видов? Почему у некоторых
видов возникают дополнительные хромосомы, которые вроде бы и не
нужны?
— Дополнительные — это хорошо или плохо?
— У человека дополнительная хромосома — это отклонение от нормы,
что всегда чревато осложнениями. Но есть виды, у которых
сверхчисленные хромосомы — норма. Более того, известны случаи,
когда их число может превышать два десятка.
* * *
Николай Борисович рассказал еще много интересного «из жизни
хромосомы», а потом привел меня в «святая святых» — помещение,
где установлен конфокальный лазерный микроскоп и где
поддерживаются соответствующие условия для его нормальной работы
(температура, влажность и т.д.). Продемонстрировал огромные
возможности работы ультрасовременного прибора.
Впечатляет!
Фото Е. Ильницкой
стр. 6-7
|
