«Наука в Сибири» № 12 (2697) 26 марта 2009 г. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПОТЕНЦИАЛА Активное участие в работе над интеграционными проектами СО РАН принимают все институты Отделения. Институт химической биологии и фундаментальной медицины, который этой весной отмечает свой 25-летний юбилей, — не исключение; его сотрудники задействованы сразу по нескольким направлениям. Ю. Александрова Сегодня о проекте «Определение противоопухолевого потенциала интерферирующих РНК пролонгированного действия in vivo» рассказывает его координатор, к.х.н. Елена Леонидовна Черноловская. — Онкологические заболевания являются одной из главных проблем современной медицины. Существующие в настоящее время схемы лечения злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе с высокодозной агрессивной химиотерапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность имеющихся противоопухолевых препаратов в отношении жизненно важных органов и систем организма. Продукты генов, участвующих в развитии раковых заболеваний, относятся к разным классам белков, поэтому прямым подходом к получению ингибиторов этих генов является использование геномных и постгеномных технологий с целью создания олигонуклеотидных конструкций, способных избирательно связываться с мРНК гена-мишени и инактивировать ее. Во всем мире ведутся работы по созданию средств регуляции экспрессии терапевтически значимых генов, но пока ни один препарат не вышел на рынок. Однако целый ряд зарубежных фармацевтических компаний проводят клинические и доклинические испытания препаратов на основе немодифицированных siРНК. В Сибирском отделении Российской академии наук достигнут существенный прогресс в разработке и использовании интерферирующих РНК в биомедицинских целях. За достаточно короткий срок — около десяти лет, прошедший с момента обнаружения механизма РНК интерференции у млекопитающих, получены приоритетные результаты о закономерностях функционирования этого механизма в клетке. Наш интеграционный проект рассчитан на три года и связан с исследованиями, которые уже некоторое время — с двухтысячного года — ведутся в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот под руководством академика В. В. Власова и д.б.н. М. А. Зенковой. Его целью является проведение фундаментальных исследований, направленных на определение противоопухолевой активности интерферирующих РНК на лабораторных животных и первичных культурах клеток, полученных от больных лимфомами и лейкозами. Проводимые в лаборатории исследования посвящены разработке регуляторов экспрессии гена на основе интерферирующих РНК, которые представляют собой короткие двуцепочечные молекулы, способные находить среди всего разнообразия РНК в клетках только ту последовательность, которая им соответствует. В комплексе с клеточными белками эти короткие интерферирующие РНК связываются со своей мишенью и избирательно ее расщепляют. Таким образом, мы можем вызвать расщепление в клетке рибонуклеиновых кислот, регуляция экспрессии которых нарушена (это может понадобиться в случае раковых заболеваний). Нарушения экспрессии могут приводить к образованию либо слишком большого количества продукта гена, либо измененного продукта гена в результате мутации или возникновения химерного гена, который в норме не наблюдается, а является составленным из двух нормальных генов, что приводит к развитию патологических состояний. Экспрессия онкогена или измененного варианта клеточного гена приводит к нарушению регуляции клеточного цикла, выражающегося в раковой трансформации клетки и ее неконтролируемом делении. Нарушения могут касаться белков различной природы, поэтому получение ингибиторов, направленных на инактивацию самого белка, это длительный и трудоемкий процесс, индивидуальный для каждого белка-мишени. Однако кодирующие все эти белки РНК состоят всего из четырех вариантов нуклеотидов; соответственно, исходя из этого, мы можем сделать ингибиторы, которые будут представлять из себя фрагменты нуклеиновой кислоты, способные связывать и инактивировать РНК-мишени. Интерферирующая РНК как раз и является универсальным инструментом, который способен инактивировать продукты подобных генов. Эти ингибиторы могут быть снабжены определенными химическими модификациями для того, чтобы они приобрели нужные нам свойства, такие как стабильность в кровотоке, способность проникать в клетки. В лаборатории биохимии нуклеиновых кислот созданы ингибиторы экспрессии некоторых терапевтически значимых генов. Прежде всего, это ген MDR1, ген множественной лекарственной устойчивости, который отвечает за развитие устойчивости раковых клеток к цитостатикам. Когда в раковых клетках наблюдается экспрессия этого гена, образуется белок, который выводит лекарственные препараты из клетки, за счет чего не наблюдается терапевтический эффект. Для того, чтобы восстановить чувствительность клеток к лекарственным препаратам, необходимо подавить экспрессию гена. Другие интересные мишени — это гены семейства myc (c-myc и N-myс), ответственные за развитие нейробластом. Нами разработан химерный ингибитор, способный подавлять экспрессию обоих этих генов и замедлять или даже полностью блокировать деление раковых клеток различных типов нейробластом. Во многих случаях при раковых заболеваниях антипролиферативное действие могут оказывать агенты, которые способны активировать в самом организме синтез цитокинов и интерферонов. В нашей лаборатории идентифицирован такой агент, который представляет собой вариант короткой РНК (она только на один нуклеотид длиннее, чем стандартная интерферирующая РНК). Эта РНК не имеет мишени среди клеточных РНК, а является как раз индуктором интерферона. Все эти исследования были проведены, главным образом, в культурах раковых клеток человека различного происхождения, было показано эффективное антипролиферативное действие и подана заявка на патент. Что касается интеграционного проекта «Определение противоопухолевого потенциала интерферирующих РНК пролонгированного действия in vivo», он направлен на определение терапевтического потенциала этих препаратов уже на более высоком уровне. Наряду с двумя лабораториями Института химической биологии и фундаментальной медицины, в проекте участвуют наши коллеги-медики из Новосибирской государственной медицинской академии, в частности, профессор Т. И. Поспелова, которая давно сотрудничает с нами. Совместно с ними будут получены и охарактеризованы первичные культуры раковых клеток, и на этих первичных культурах пройдут испытания наших препаратов. Другая часть этой работы — определение эффективности действия препаратов в экспериментах на животных. Тут подключается третий участник интеграционного проекта — Институт цитологии и генетики (к.б.н. Н. А. Попова, к.б.н. В. И. Каледин, к.м.н. В. П. Николин). Они имеют очень большой опыт работы именно на животных, в Лаборатории регуляции экспрессии генов получена и охарактеризована большая коллекция опухолевых клеток, с помощью которых у мышей можно получить опухоли различной локализации и различного происхождения. Эти животные как раз и будут использованы в качестве модели для определения противоопухолевого потенциала разработанных нами препаратов. Исследования в рамках данной тематики идут по нескольким направлениям: подбор генов-мишеней для действия ингибиторов, разработка способов доставки в клетки и ткани, различные химические модификации, которые улучшают эффективность и длительность биологического действия. Естественно, если препараты должны применяться не в культуре клеток, а на животных или, в перспективе, на людях, требуется, чтобы препарат был стабилен, поскольку его инъекция либо в кровь, либо внутримышечно предполагает контакт с плазмой и сывороткой крови. Мы научились получать нуклеазоустойчивые препараты, которые стабильны в присутствии сыворотки крови в течении длительного времени, при этом сохраняется их биологическая активность (ведь во многих случаях химические модификации снижают активность). Был предложен алгоритм селективной модификации, который позволяет вводить минимальное количество неприродных аналогов в состав нуклеиновой кислоты, при этом достигается высокая устойчивость и обеспечивается длительный эффект. Работа по химической модификации ведется совместно с другим подразделением ИХБФМ — лабораторией химии РНК, под руководством к.х.н. А. Г. Веньяминовой. Они синтезируют все используемые нами олигорибонуклеотиды, подготовили большую серию липофильных соединений — ведь присоединение липофильных остатков помогает этим соединениям попадать внутрь клеток. Среди этой серии есть очень перспективные молекулы, которые без использования специальных трансфекционных агентов способны попадать в клетки. Мы надеемся, что это направление позволит снизить концентрации и получить биологический эффект уже не только на культуре клеток, но и на уровне организма. Интеграционный проект «Определение противоопухолевого потенциала интерферирующих РНК пролонгированного действия in vivo» состоит из нескольких частей. Это, прежде всего, совершенствование химической структуры для применения в масштабах организма; гидрофобизация; кроме того, предполагается цикл работ по исследованию получения мультимеров этих соединений, что необходимо для обеспечения более длительной циркуляции в кровотоке. В перспективе — создание препарата, на что мы очень рассчитываем. Однако это уже новый этап, в котором возникнет много нюансов. Потребуется проведение опытно-конструкторских работ, которые позволили бы получать лекарство в достаточно большом количестве, определить фармацевтическую композицию в составе которой он будет использоваться, стабильность и т.д. И, естественно, потребуется проведение доклинических и клинических испытаний. стр. 5