Координатор: канд. хим. наук Зенкова М. А.

Исполнители: НИБХ, ИЦГ СО РАН

Исследованы способности олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам мРНК mdr1, снижать ее количество в культуре клеток линии КВ-8-5, имеющих в 6—8 раз повышенный уровень экспрессии этой мРНК по сравнению с родительской линией КВ-3-1. Обнаружено, что конъюгаты олигонуклеотидов, несущие биспиренильные и аминопропильные группы на 5’ и 3’ концах, соответственно, комплементарные участку 319-333 кодирующей области и участкам 150-165 и 122-137 в области AUG кодона, снижают уровень экспрессии mdr1 мРНК в клетках на 90, 50 и 40 % соответственно (рис. 1). Олигонуклеотиды, не способные гибридизоваться с mdr1 РНК in vitro, не влияют на уровень mdr1 РНК в клетках. Идентифицирован перспективный олигонуклеотид, комплементарный участку 319-333 mdr1 мРНК, модифицированные аналоги которого могут быть использованы для обращения фенотипа PgP/mdr in vivo.

Рис. 1. Ингибирование экспрессии mdr1 мРНК в клетках КВ-8-5 антисмысловыми олигонуклеотидами (ордината). Уровень экспрессии mdr1 мРНК в контрольных клетках принят за 100 %. Fig. 1. Inhibition of mdr1 mRNA expression by 5'-bis-pyrenyl-3'-aminohexyl antisense oligonucleotide conjugates in KB-8-5 cells as estimated by RT-PCR. 100 % corresponds to the mdr1 mRNA level in the control untreated cells.

Исследована возможность подавления экспрессии гена mdr1 в клетках линии KB-8-5 с помощью синтетических 21-звенных двуцепочечных олигорибонуклеотидов. В присутствии олигонуклеотидной конструкции siE, комплементарной району 315—335 мРНК, в концентрациях выше 5 нм в клетках наблюдается полное исчезновение мРНК mdr1(рис. 2). Исследование кинетики процесса показало, что снижение уровня mdr1 мРНК происходит после 16—18 ч инкубации в присутствии олигонуклеотида и через 24 ч детектируется минимальный уровень мРНК mdr1, после чего снижение концентрации mdr1 мРНК наблюдается в клетках в течение еще по крайней мере трех суток. Олигонуклеотид siI, гомологичный последовательности интрона и не имеющий мишени в составе мРНК, в концентрациях 5—50 нм не влиял на уровень mdr1 мРНК в клетках.

Рис. 2. Ингибирование экспрессии гена mdr1 в клетках KB-8-5 с помощью siРНК. Данные RT-PCR-анализа. 1 - соответствует соотношению экспрессии генов mdr1 и b-актина в контрольных клетках. Fig. 2. Inhibition of mdr1 mRNA expression by siRNA in KB-8-5 cells as estimated by RT-PCR. 1 corresponds ratio of the mdr1/b-actin mRNA level in the control untreated cells.

Антисенс-технология обладает достоинством избирательного угнетения экспрессии гена в определенной группе клеток, на которые антисмысловой олигонуклеотид может быть локально апплицирован. В наших опытах введенный в область синего пятна ствола головного мозга взрослых крыс антисмысловой олигонуклеотид к мРНК альфа2А-адренорецептора специфически снижал уровень этой мРНК, определенный методом RT-PCR, а также ингибировал оцененную радиолигандным методом экспрессию рецепторного белка в этом отделе мозга (рис. 3).

Таким образом, проведено комплексное исследование подавления экспрессии гена мишени в культуре раковых клеток и в животных с помощью производных олигонуклеотидов различной природы. Показано, что применение антисмысловых олигонуклеотидов, их модифицированных аналогов и коротких РНК-дуплексов (siРНК) приводит к специфическому снижению уровня целевых мРНК в культуре клеток и у лабораторных животных.

Рис. 3. Подавление экспрессии гена альфа2а-адренорецептора (Alpha2A-AR) антисмысловым олигонуклеотидом в развивающемся головном мозге крыс, оцененное РТ-ПЦР. Снизу — уровень экспрессии гена b-актина, использованный в качестве внутреннего стандарта при анализе уровня экспресии гена альфа2-адренорецептора. SAL — физиологический раствор (дорожки 1 и 2); RANDOM — случайный олигонуклеотид (дорожки 3—6); ANTISENSE — олигонуклеотид, комплементарный мРНК гена альфа2а-адренорецептора (дорожки 7—12). Fig. 3. Down-regulation of alpha2-adrenoreceptor gene (Alpha2A-AR) with antisense oligonucleotides in the brains of newborn rats as assayed by RT-PCR. The level of b-actin expression used as internal standard is shown at the bottom. SAL — physiological solution, control, lanes 1—2; RANDOM — scrambled oligonucleotide, lanes 3—6; ANTISENSE — oligonucleotide complementary to alpha2-adrenoreceptor mRNA, lanes 7—12.

Список основных публикаций

1. Dygalo N. N., Kalinina T. S., Shishkina G. T. Regulation of alpha2A-adrenergic receptor expression in the rat brain by testosterone// Trabajos del Instituto Cajal. 2001. v. 78. p. 76—77.

2. Shishkina G. T., Kalinina T. S., Sournina N. Yu., Dygalo N. N. Effects of antisense to the alpha2A-adrenoceptors administered into the region of the locus coeruleus on behavior in plus-maze and sexual behavior tests in sham-operated and castrated male rats// Journal of Neuroscience. 2001. v. 21, N 2. P. 726—731.

3. Dygalo N. N., Kalinina T. S., Shishkina G. T. Biological efficacy of antisense oligonucleotides complementary to overlapping regions of the mRNA target// Russian Chemical Bulletin, International Edition. 2002. v. 51, N 7. p. 1118—1121.

4. Dygalo N. N., Kalinina T. S., Sournina N. Y., Melnikova L. B. Effects of neonatal treatment with antisense oligodeoxynucleotide to alpha2A-adrenergic receptor on noradrenergic system of rat brain// Stress: Neural, Endocrine and Molecular Studies/ Edit. R. McCarty, G. Agulera, E. Sabban, R. Kvetnansky. London, New York, Philadelphia, Singapore: Taylor & Francis Group, 2002. p. 205—209.

5. Shishkina G. T., Kalinina T. S., Sournina N. Y., Saharov D. G., Kobzev V. F., Dygalo N. N. Effects of antisense oligodeoxynucleotide to the alpha2A-adrenoceptors on the plasma corticosterone level and on elevated plus-maze behavior in rats// Psychoneuroendocrinology. 2002. v. 27, N 5. p. 593—601.

6. Zenkova M. A., Sil’nikov V. N., Beloglazova N. G., Giegй R., Vlassov V. V. RNA Cleaving 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane-Imidazole Conjugates// Meth. in Enzmol. 2001. V. 341. P. 468—490.

7. Polushin S. N., Malykh N. A., Malykh A., Zenkova O., Chumakova M., Vlassov N., Kozyavkin V., 2’-modified oligonucleotides from methoxyoxalamido and succinimido precursors: synthesis. Properties and applications// Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. V. 20, N 4—7. P. 507—514

8. Kostenko E. V., Dobrikov M. I., Komarova N. I., Pyshniy D. V., Vlassov V. V., Zenkova M. A. 5’-bispyrenylated oligonucleotides display enhanced excimer fluorescence upon hybridization with DNA// Ibid. v. 20, N 10—11. P. 1856—1870.

9. Kostenko E. V., Dobrikov M. I., Pyshniy D. V., Komarova N. I., Vlassov V. V., Zenkova M. A.// 5’bis-pyrenylated oligonucleotides displaying excimer fluorescence provide sensitive probes of rNA sequence and structure// Nucleic Acids Res. 2001. V. 29, N 17. P. 3611—3620.

10. Chernolovskaya E. L., Koshkin A. A., Vlassov V. V. Interaction of LNA oligonucleotides with mdr1 promoter// Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2001. V. 20, N 4—7. P. 847—850.

11. Kostenko E. V., Laktionov P. P., Vlassov V. V., Zenkova M. A. Down regulation of PGY/mdr1 mRNA level in human KB cells by antisense oligonucleotide conjugates// Biochem Biophys Acta. 2002. V. 1576. P. 143—147.

12. Белоглазова Н. Г., Епанчинцев А. Ю., Сильников В. Н., Зенкова М. А., Власов В. В. Высокоэффективное сайт-направленное расщепление РНК-мишени имидазолсодержащими конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов// Молекулярная биология. 2002. Т. 36, № 4. C. 731—739.

13. Логашенко Е. Б., Черноловская Е. Л., Владимирова А. В., Репкова М. Н., Веньяминова А. Г., Власов В. В. Подавление экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости в опухолевых клетках с помощью короткой двуцепочечной РНК// Докл. РАН. 2002. Т. 386, № 2. С. 274—276.

В оглавление

Далее