РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРИНЦИПОВ КОНСТРУИРОВАНИЯ МАТЕРИАЛОВ
И СИСТЕМ ДЕТЕКЦИИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПРИБОРОВ И МЕТОДОВ
ДЛЯ МАНИПУЛИРОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРАМИ И МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Координатор: акад. Власов В. В.

Исполнители: НИБХ, КТИПМ, ИАиЭ, ИХХТ, ИХТТМ СО РАН

C целью разработки новых технологий, методов и приборов для медицинской практики и биологических работ проведены фундаментальные исследования, касающиеся процессов молекулярной гибридизации.

Разработаны оригинальные подходы к получению ДНК-чипов с использованием различных материалов — стекла, мелкодисперсных полимеров, капроновых мембран.

Разработан автоматизированный поляризационный сенсор для считывания информации с ДНК-чипов на основе стеклянных призм (рис. 1). С помощью сенсора можно измерять рефрактометрические характеристики и толщину пленки, изменяющиеся в процессе адсорбции комплементарной цепи ДНК на поверхности призмы, содержащей олигонуклеотидный зонд. Прибор демонстрировался в экспозиции СО РАН на выставке ВТ-2002 оборонного комплекса, г. Москва.

Рис. 1. Автоматизированный поляризационный сенсор для считывания информации с ДНК-чипов на основе стеклянных призм. Fig. 1. Automatic polarization sensor for reading information from DNA chips on glass prizm.

С целью создания аффинных сорбентов на магнитных носителях осуществлен поиск методов выделения магнитных микросфер из зол основных энергетических углей и методов нанесения белых отражающих покрытий на высокодисперсные порошки ферромагнитных металлов — железа, кобальта и никеля.

Базируясь на результатах фундаментальных исследований высокоселективного лигирования тандема производных трех коротких олигонуклеотидов на матричных ДНК, разработаны высокочувствительные диагностикумы для изучения однонуклеотидного полиморфизма в Y-хромосоме человека, точечной мутации R408W в гене фенилаланин гидроксилазы человека (мутация, характерная при фенилкетонурии) (рис. 2), а также для выявления мутаций в геноме ВИЧ-1, обусловливающих его устойчивость к азидотимидину.

Рис. 2. Выявление мутации R408W в образцах ДНК (184 п.о.): 1 - гомозигота, содержащая мутацию; 2 - гомозигота норма; 3-7 - гетерозиготы; М20 - контрольная 20-звенная ДНК-матрица, соответствующая норме, -М - контрольное лигирование в отсутствие матрицы. Fig. 2. Revealing mutation R408W in DNA samples (184 bp): 1 - homozigote containing mutation; 2 - homozigote of wild type; 3-7 - heterozigotes; M20 - control 20-mer target DNA corresponding to the wild type, -M - control ligation in the absence of a template.

Рис. 3. Выявление вируса гепатита С. 1-4 - ОТ-ПЦР-фрагменты клинических образцов ВГС, К - ОТ-ПЦР-фрагмент вируса клещевого энцефалита, ч/м - черный маркер. Fig. 3. Revealing Hepatite C virus: 1-4 - RT PCR fragments of clinical samples of GCV, K - RT PCR fragment of TBE, ч/м - black marker.

Для создания высокоселективных олигонуклеотидных зондов разработана новая эффективная технология выравнивания стабильности комплементарных ДНК—ДНК-комплексов с разным содержанием пар GC и AT, в основе которой лежит использование химерных “мостиковых” олигонуклеотидов, отличающихся от природных олигонуклеотидов наличием в них ненуклеотидных вставок-мостиков. Показано, что созданные химерные олигонуклеотиды, в отличие от природных олигонуклеотидов, способны надежно дискриминировать ДНК, структура которых отличается всего одним нуклеотидным основанием.

С использованием разработанных высокоселективных зондов, иммобилизованных на мелкодисперсный полимер, разработан подход к колориметрическому выявлению и генотипированию широко распространенного вируса гепатита С.

Работа по развитию и внедрению в медицинскую практику метода анализа и генотипирования вируса гепатита С получила поддержку инновационным грантом РФФИ.

1. Pyshnyi D. V., Pyshnaya I. A., Levina A. S., Goldberg E. L., Zarytova V. F., Knorre D. G., Ivanova E. M. Thermodynamic Analysis of Stacking Hybridization of Oligonucleotides with DNA Template// J. Biomol. Struct. Dyn. 2001. V. 19. P. 555—570.
2. Zarytova V. F., Skobeltsyna L. M., Dymshits G. M., Pyshnyi D. V., Pyshnaya I. V., Ivanova E. M., Levina A. S., Pokrovsky A. G. New methods for hybridization analysis of nucleic acids// Russian journal of HIV/AIDS and Related problems. 2001. V. 5. P. 133.
3. Шишкина И. Г., Левина А. С., Зарытова В. Ф. Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их фрагменты// Успехи химии. 2001. Т. 70. С. 581—608.
4. Кабилов М. Р., Пышный Д. В., Дымшиц Г. М., Гашникова Н. М., Покровский А. Г., Зарытова В. Ф., Иванова Е. М. Новый подход к выявлению анализируемой последовательности ДНК путем УФ-иммобилизации ее гибридизационного комплекса с высокоспецифичным зондом, образующимся при лигировании тандема коротких олигонуклеотидов в растворе// Молекулярн. биология. 2002. Т. 36. С. 424—431.
5. Власов В. В., Зарытова В. Ф., Левина А. С., Федоринин В. Н. Рефрактометрические исследования кинетики гибридизации комплементарных олигонуклеотидов на поверхности ДНКчипов// Микросистемная техника. 2002. № 4. С. 31—35.
6. Пышный Д. В., Скобельцына Л. М., Иванова Е. М., Зарытова В. Ф. Тест-системы для выявления точечных мутаций в структуре ДНК// Наука — производству (в печати).
7. Левина А. С., Михалева Е. А., Федоринин В. Н., Бессмельцев В. П., Зарытова В.Ф., Власов В. В. Гибридизационный анализ фрагментов нуклеиновых кислот с использованием поляризационного биосенсора// Там же.

Оглавление

Далее