ВЫЯВЛЕН РЯД ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ
Антитела-нуклеазы человека
в норме и при аутоиммунных патологиях
Т.Канышкова, аспирант НИБХ СО РАН,
лаборатория ферментов
репарации.
 |
|
Аспиранты Татьяна Канышкова и Дмитрий Бугреев -- руководители
молодежного проекта "Белково-нуклеиновые взаимодействия в системах
защиты клетки от внешних воздействий"
|
Антитела, или иммуноглобулины являются наиболее важными белками в
системе защиты организма от различного рода патогенов. Их
классическая роль заключается во взаимодействии со специфическими
чужеродными антигенами, которое приводит к нейтрализации
токсинов, чужеродных микроорганизмов и последующему их удалению
из организма. Интересно, что система гуморального иммунитета
способна таким образом бороться практически с любыми патогенами.
Защитный потенциал иммунной системы поистине огромен, однако
механизмы ее функционирования все еще до конца не раскрыты.
МАРКЕРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
Сравнительно недавно возникла новая область, которая называется
абзимология. Основным направлением этой науки является изучение
новой уникальной функции антител -- их способности катализировать
различные реакции. Уже с середины 60-х годов в литературе
появляются упоминания о направленном "создании" антител,
способных осуществлять катализ различных химических реакций.
Первые такие антитела-ферменты или, как их сейчас называют,
абзимы были получены с использованием метода иммунизации
лабораторных животных стабильными аналогами субстратов и
последующего выделения и отбора клонов В-лимфоцитов, способных
продуцировать антитела с заданными каталитическими свойствами. В
целом, с использованием подхода направленного дизайна за
последние 30 лет были получены антитела, способные катализировать
широкий спектр различных реакций. К настоящему времени в
литературе описано более 50-ти примеров индуцированных абзимов с
заданными свойствами.
Успешные эксперименты по дизайну моноклональных абзимов
стимулировали возникновение нового витка в исследованиях свойств
и функций иммуноглобулинов in vivo. Такие исследования привели к
открытию природных абзимов -- каталитических антител, продукция
которых в организме не была индуцирована какими-либо внешними
воздействиями. Исследования за последнее десятилетие достоверно
показали существование природных абзимов при ряде аутоиммунных
патологий, и их возникновение вполне правомерно связывают с
аутоиммунизацией организма в результате подобных заболеваний.
Стало очевидным, что появление абзимов является общей тенденцией
ответа иммунной системы высших организмов при тяжелых поражениях.
 |
|
Профессор Г.Невинский заслушивает отчеты студентов и аспирантов
лаборатории о проделанной работе
|
Следует особо отметить, что антитела-ферменты, как правило,
отсутствуют в организме здоровых людей (или же их количество
чрезвычайно мало), поэтому до недавнего времени вопрос о
возможности существования абзимов в отсутствие аутоиммунных
патологий оставался открытым. Однако, недавно было показано, что
антитела молока здоровых рожениц способны проявлять
ферментативные свойства. Первые работы по исследованию
каталитической функции антител в организме доноров без каких-либо
патологий иммунной системы были посвящены секреторным
иммуноглобулинам класса А, обладающим протеинкиназной
активностью. Несколько позже нами было обнаружено, что антитела
материнского молока способны расщеплять нуклеиновые кислоты. В
течение последних пяти лет в лаборатории ферментов репарации НИБХ
СО РАН успешно развивается новое направление иммунологии --
исследование абзимов-нуклеаз человека в норме и при различных
аутоиммунных патологиях.
Основной трудностью подобного рода исследований является
доказательство принадлежности каталитической функции именно
антителам, а не каким-либо примесным белкам. Это обусловлено
следующими фактами. Известно, что антитела способны связывать
различные белки очень прочно. Поэтому существует вероятность
того, что некоторые ферменты (скажем, ДНКазы или РНКазы) могут
совыделяться с антителами. Таким образом, даже если процент таких
примесей минимален, нуклеазная активность иммуноглобулинов может
быть обусловлена активностью примесных ферментов. Вторая проблема
связана с поликлональностью антител. Обусловлено это тем, что
несмотря на вполне определенную пространственную структуру,
первичная последовательность их антигенсвязывающего района
чрезвычайно вариабельна.
Поэтому в плане структурных исследований активного центра
абзимов, да и, собственно, кинетических параметров реакции,
вполне закономерно возникновение трудностей. Пути к преодолению
этого препятствия -- получение человеческих моноклональных
антител (т.е. белков с определенной первичной структурой, иначе
говоря, антител, гомогенных на уровне последовательности
аминокислот). К сожалению, уровень развития современной биологии
пока не позволяет получать функциональные моноклоны лимфоцитов
человека, но стратегия перехода от исследований суммарного пула
антител к моноклональным абзимам со временем может быть весьма
перспективной.
С самого начала работы для того, чтобы исключить все возможные
артефакты, нами был разработан ряд критериев доказательства
ферментативной функции иммуноглобулинов. Прежде всего, это
касалось метода их выделения. Такой метод, с одной стороны должен
был обеспечить получение гомогенного (т.е. ферментативно чистого)
препарата, но, с другой стороны, не должен был драматически
сказываться на собственной каталитической активности антител.
Успешное решение данной задачи, а также адаптация известных
методик фрагментации антител разных классов применительно к
задачам абзимологии позволили нам выявить ряд закономерностей
каталитического действия абзимов-нуклеаз человека при
аутоиммунных патологиях и без таковых:
-- антитела-нуклеазы гораздо более эффективно расщепляют
протяженные участки ДНК и РНК, чем короткие модельные
олигонуклеотиды-субстраты;
-- кинетические характеристики абзимов, возникающих при
аутоиммунных заболеваниях, и абзимов молока в значительной
степени сопоставимы. Интересно, что по эффективности
каталитического действия абзимы, как правило, "проигрывают"
обычным ферментам -- ДНКазам, РНКазам и фосфатазам, но они
связывают субстрат (ДНК или РНК) значительно более прочно.
Разница в сродстве у абзимов и ДНКаз или РНКаз может достигать
2-3 порядков;
-- субстратная специфичность реакции гидролиза нуклеиновых кислот
отлична от специфичности действия классических ферментов. С
другой стороны, специфичность гидролиза нуклеиновых кислот
абзимами молока отличается от специфичности абзимов при
аутоиммунных заболеваниях, при этом характер расщепления
субстрата определяется типом заболевания и даже, зачастую,
индивидуален для определенного донора;
-- абзимы-нуклеазы чувствительны не столько к первичной
последовательности нуклеиновых кислот, сколько к определенным
элементам ее пространственной структуры.
Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что каталитически
активные антитела, во-первых, могут быть использованы в
практической медицине как дополнительный маркер при диагностике
типа аутоиммунного заболевания. Кроме того, с точки зрения
фундаментальной биохимии, абзимы могут найти применение в
качестве структурных проб для характеризации конформационных
изменений молекул ДНК и РНК с развитой пространственной
структурой.
АКТИВНЫЙ ЦЕНТР АБЗИМОВ-НУКЛЕАЗ
Существует несколько подходов, с помощью которых можно
определить, где именно на молекуле белка расположен активный
центр (т.е. тот участок молекулы, в котором и происходит катализ
реакции). Один из таковых -- это широко используемый в биохимии
метод аффинной модификации белков с помощью химически активных
аналогов субстрата. Используя данный подход, нами было показано,
что ДНК- и РНК-связывающие центры образованы N-концевыми
участками легких и тяжелых цепей молекулы антитела, а именно эта
ее часть, как известно, ответственна за связывание с антигеном.
Второй используемый метод -- это фрагментация нативной молекулы
иммуноглобулина и выделение субъединиц, обладающих каталитической
функцией.
Таким способом было показано, что каталитический (т.е. ДНК- и
РНК-гидролизующий) центр локализован в той же области, что и
связывающий. Это являлось закономерностью для всех классов
исследуемых абзимов, причем как при аутоиммунных патологиях, так
и в отсутствие таковых. Более того, с использованием третьего
подхода была продемонстрирована исключительная консервативность
каталитического центра абзимов разных классов. Эта
консервативность заключалась в том, что в формировании центра,
ответственного за катализ, принимает участие исключительно легкая
цепь молекулы.
Сей замечательный факт был показан с помощью разработанного нами
теста на ферментативную активность in situ. Суть данного метода
заключается в следующем: абзимы или их отдельные субъединицы
подвергаются электорофоретическому разделению в геле, в котором
уже находится субстрат (ДНК или РНК). Затем ферментативная
активность белка специальным образом восстанавливается и далее
тестируется по гидролизу субстрата в геле. Замечательно, что с
помощью такого подхода по специфической окраске можно обнаружить
и белки, и нуклеиновые кислоты. Следовательно, можно судить о
ферментативной функции конкретного белка.
На наш взгляд такой подход в плане исследования каталитической
функции абзимов, в целом, является наиболее показательным и
достоверным: во-первых, он дает возможность продемонстрировать,
что каталитическая активность принадлежит именно
иммуноглобулинам, а во-вторых, есть возможность довольно точно
определить, какие именно субъединицы белка участвуют в катализе.
О ВОЗМОЖНЫХ ПУТЯХ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ПРИРОДНЫХ АБЗИМОВ
Одним из наиболее интригующих вопросов абзимологии является
причина возникновения антител-ферментов. До сих пор непонятно,
какую роль выполняют абзимы: являются ли они одним из поражающих
факторов, или же, напротив -- это своего рода защитная реакция
организма на внешние или внутренние патологические изменения.
Основные механизмы генерации антител-ферментов к настоящему
времени хорошо изучены в экспериментах с моноклональными
антителами (так называемыми неприродными или "индуцируемыми"
абзимами). Однако возможность реализации того или иного варианта
in vivo, в случае с природными поликлональными абзимами оценить
достаточно проблематично. Тем не менее, существует несколько
моделей индукции каталитических антител.
Одним из способов генерации абзимов может быть антиидиотипический
механизм. В рамках данной теории антигеном, запускающим продукцию
первичных антител, является "обычный" фермент. Далее на первичные
антитела формируется вторичный иммунный ответ, что приводит к
появлению вторичных, так называемых антиидиотипических антител.
Такие вторичные антитела по структуре своего антиген-связывающего
центра похожи на исходный фермент и, следовательно, могут
обладать той же активностью. Существует гипотеза, согласно
которой ДНК-гидролизующие антитела являются антиидиотипами к
ферментам -- ДНКазе I и топоизомеразе I.
Вторая принципиальная возможность -- возникновение абзимов
непосредственно к аутоантигенам. Иными словами, механизм
возникновения природных каталитических антител может быть
обусловлен увеличением (по каким-либо причинам) концентрации
собственного антигена. Таким образом, запускающий такой процесс
антиген и будет подвергаться каталитической трансформации с
помощью абзимов. Известно, что наиболее эффективные неприродные
абзимы -- это антитела, полученные на стабильные аналоги
переходных состояний химических реакций. Очевидно, что такого
рода аналогов в организме не существует. Тем не менее, генерация,
скажем, ДНК-абзимов по аналогичному пути in vivo вполне возможна.
Так, например, многие аутоиммунные заболевания сопровождаются
массовой гибелью клеток, что приводит к циркуляции комплексов ДНК
с белками ядерного матрикса. Таким образом, вполне возможно, что
наработка антител к таким комплексам (в которых структура ДНК
может быть деформированной или напряженной) приводит к генерации
абзимов, способных расщеплять нуклеиновые кислоты.
При выборе механизма возникновения абзимов-нуклеаз у человека
особый интерес имеют параллельные исследования каталитических
свойств антител при патологиях иммунной системы и в отсутствие
таковых. Казалось бы -- что может быть общего между аутоиммунным
заболеванием и состоянием беременности? Но тем не менее,
определенное сходство есть. Существует ряд общих параметров, по
которым можно проследить сходство состояния иммунной системы при
аутоиммунных расстройствах с состоянием иммунной системы женщин
при беременности и в послеродовой период.
Одним из таких параметров является увеличение в кровотоке титра
внеклеточной ДНК. Это явление характерно практически для любого
аутоиммунного заболевания, и сходная картина наблюдается в
течение первого триместра беременности у здоровых женщин. Кроме
того, при аутоиммунных патологиях в организме больного происходит
массовая гибель клеток по механизмам апоптоза. Результаты же
недавних исследований показывают, что сходные процессы происходят
у беременных в последний триместр, непосредственно перед родами.
Мы полагаем, что именно "дисбаланс" нуклеиновых кислот в
организме может приводить к пролиферации клонов В-лимфоцитов,
способных продуцировать антитела-нуклеазы -- абзимы, которые
будут способствовать выведению избытка нуклеиновых кислот из
кровотока.
Интересно, что истинные аутоиммунные процессы в настоящее время
практически не поддаются коррекции и характеризуются хроническим
течением с периодически возникающими обострениями. В отличие от
этого, специфическое состояние иммунной системы женщин в период
беременности и лактации является временным и, как правило, не
ведет к развитию каких-либо патологий. Вероятно, в этот период
иммунная система матери мобилизует все возможные механизмы
действия, направленные на эффективную защиту не только своего
организма, но и новорожденного, от воздействия различных
патогенных факторов окружающей среды. С нашей точки зрения,
разумно предположить, что именно в каталитической активности
антител может также находить свое выражение природа защитного
потенциала иммунной системы в особых случаях: таких как
беременность и лактация, а также различного рода аутоиммунных
расстройствах.
* * *
В течение 1997-1999 гг. работа нашего коллектива была поддержана
Сибирским отделением РАН как молодежный проект, что, безусловно,
способствовало ее успешному осуществлению. Получение финансовой
поддержки не только способствовало проведению исследований, но и
стимулировало формирование системы взаимовыгодных контактов с
рядом медицинских учреждений г.Новосибирска, что является
немаловажным условием последующего развития научных работ в
данном направлении. Вне всяких сомнений, наиболее значимые и
интересные результаты в этой области науки возможны лишь на стыке
биологии, биохимии и медицины. Внимание Сибирского отделения к
работам молодых ученых, с этой точки зрения, весьма весомо. Это
еще раз подтвердила недавно прошедшая научная сессия, заслушавшая
итоги работ -- выделенные Президиумом СО РАН гранты не только
способствовали выявлению молодых ученых-лидеров, но и созданию
неформальных молодежных коллективов, зачастую междисциплинарных и
разнопрофильных.
стр.
|
